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摘要：溶瘤病毒（OVs）最近在癌症治疗领域引起了极大的兴趣。特别是，OVs可通过OV内在作用或免疫刺激剂的输送，帮助CAR-T细胞克服肿瘤微环境（TME）内的某些免疫抑制机制。大量的临床前研究表明，将CAR-T细胞与OVs结合可以增加CART细胞的运输，抗肿瘤活性以及消除抗原阴性肿瘤细胞。尽管临床前结果令人鼓舞，但只有一项正在进行的研究将CART和OV组合疗法进行研究的临床试验（NCT），突显了将这种方法应用于临床的挑战。

尽管在靶向血液恶性肿瘤方面取得了总体成功，但CAR-T治疗在实体瘤的背景下仍在挣扎。肿瘤微环境（TME）内的各种因素都会抑制T细胞功能（图A）[6]。已知肿瘤细胞会上调PD-L，从而负面调节T细胞功能，并且肿瘤细胞还会诱导肿瘤相关的巨噬细胞（TAM）朝着T细胞极化。免疫抑制表型，通过多种表面受体（例如CTLA-4）和细胞因子（例如TGF-β）进一步阻碍T细胞功能。另外，肿瘤将骨髓来源的抑制细胞（MDSC）募集到TME，在那里它们阻止T细胞浸润并代谢抑制T细胞。长期暴露于TME中的抗原会促进调节性T细胞（Treg）的分化，这些Treg通过分泌IL-0和TGF-β，代谢破坏常规T细胞并裂解效应性T细胞来促进免疫抑制环境[7]。TME还诱导PD-L和吲哚胺,3双加氧酶（IDO）的上调，具有免疫抑制表型的特征，这会阻碍免疫反应[6]。此外，TME通过破坏T细胞外渗并将T细胞捕获在密集的基质网络中而排除了T细胞[8]。克服这些免疫抑制的物理和分子机制可能会提高CART细胞疗法在实体瘤中的疗效。

溶瘤病毒（OVs）是在癌组织中选择性感染并复制的病毒，同时保留了正常组织[6,7]，目前正在进行许多涉及OVs的临床试验[8]。参考文献[7,9,0]对设计肿瘤特异性OV的策略进行了综述。

简而言之，肿瘤细胞内固有的先天抗病毒途径缺陷，例如干扰素应答被抑制，可使减毒病毒在肿瘤组织中复制。或者，可将病毒基因置于肿瘤特异性启动子（例如人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子）下，以防止病毒基因在正常细胞中转录。确定病毒嗜性的一种更有针对性的方法是在病毒基因组中添加组织特异性microRNA，从而使遭受OV相关毒性的组织中的病毒基因沉默，从而防止肿瘤外的副作用[]。OV通过直接裂解肿瘤细胞发挥其抗肿瘤作用[]。OV介导的肿瘤细胞裂解导致向TME中释放肿瘤相关抗原（TAA），病原体相关分子模式（PAMP）和危险相关分子模式（DAMP）。

这些促炎分子重新激活了局部免疫反应，并为先天和适应性免疫T细胞提供激活信号[5,6]，有助于清除肿瘤细胞（图B）。注意，OVs还可诱导针对病毒表位的免疫反应，从而限制了OV的肿瘤内扩散，尽管已观察到抗病毒免疫增强了OV治疗的抗肿瘤作用[]。

除了OV的内在作用外，许多研究小组还设计了带有转基因的OVs[0]，旨在帮助T细胞克服免疫抑制性TME（图C）。OVs的免疫刺激特性以及用治疗性转基因武装OVs的潜力，使其在体内增强CART细胞。

在这里，我们总结了临床试验中目前的OV，并讨论了OV如何在临床前模型中与CART细胞结合以改善肿瘤控制。此外，我们重点介绍了尚待开发的有希望的组合，并讨论了OV和CART组合疗法面临的转化挑战。

----溶瘤病毒单药治疗的临床结果----

目前临床试验中的绝大多数OVs都经过了基因改造，以增强其肿瘤特异性的向性。溶瘤性单纯疱疹病毒型（oHSV-）衍生物是第一个获得FDA批准用于黑色素瘤治疗的OV[9]。oHSV-是通过删除神经毒力基因以防止致病性和删除病毒感染的细胞蛋白而产生的47（ICP47）可提供肿瘤特异性，因为ICP47通常会干扰抗原加载和呈递[30]。尽管许多临床试验证明了天然oHSV-的安全性，但并不能有效改善患者的预后[3]。

但是，用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）基因“武装”创建的talimogenelaherparepvec（TVEC）是获得抗黑色素瘤临床疗效的关键[30]。GM-CSF增强T细胞活化和树突状细胞的成熟[3]，感染TVEC的肿瘤细胞在病毒裂解后将GM-CSF释放到TME中，显着改善了患者的预后[33，34]。

参考文献中可以找到有关OV治疗的详尽综述。简而言之，OV单药治疗有几个重要的经验教训。OV疗法的一个主要限制是由于抗病毒免疫而限制了肿瘤内扩散。OV的递送方式和对OV的修饰可延迟OV的清除，但临床研究表明抗病毒免疫力与抗肿瘤免疫力密切相关，需要实现这两种免疫反应之间的平衡[8]。另一个关键发现是，即使尽管OVs直接溶解肿瘤细胞，但各种研究表明T细胞在溶瘤病毒的抗肿瘤作用中起着至关重要的作用[36]。此外，OVs增加了CD8+T细胞对肿瘤的浸润，使肿瘤对T细胞更易感[37]。因此，尽管单药疗法取得了有限的成功，但OVs仍可能与其他免疫疗法（如过继细胞疗法和免疫检查点抑制剂）协同作用[38，39]。

----CART和武装溶瘤病毒联合疗法----加强激活和递送至实体瘤：

许多实体瘤会破坏内皮细胞上的粘附分子表达，减少趋化因子的产生并分泌细胞外基质（ECM）成分，从物理上将T细胞排除在肿瘤细胞之外，从而干扰免疫细胞的浸润[8]。

加载了RANTES基因（一种促进效应子和记忆T细胞迁移的趋化因子）和IL-5，显示出将CAR-T细胞活性增强到溶瘤腺病毒（Ad5Δ4）中的作用[40]。在成神经细胞瘤异种移植模型中，武装OV的局部治疗与GD特异性CAR-T细胞的全身性输注相结合，由于产生RANTES和IL-5，从而改善了肿瘤控制，从而增强了CART细胞向肿瘤细胞的运输。肿瘤和这些细胞在TME中的持久性。一种类似的方法是使用带有另一种趋化因子CXCL的牛痘OV[4]，CXCL是另一种通过与CXCR3相互作用吸引效应T细胞的趋化因子，已知它由效应T细胞高度表达。因此，趋化因子的富集与效应T细胞上表达的受体相匹配。促进CART细胞募集到肿瘤，从而改善肿瘤控制。

携带肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-（IL-）并结合间皮素特异性CART细胞的腺病毒在胰腺导管腺癌模型中也显示出对肿瘤控制的改善[4]。IL-不会直接吸引T细胞，已知它们会诱导趋化因子的产生，并且在他们的模型中，作者报道了肿瘤内CXCL0和巨噬细胞趋化蛋白（MCP-）的增加，二者均起效应子T的趋化剂的作用[4]。这些结果表明，即使在免疫抑制性实体瘤的情况下，配备促炎细胞因子和趋化因子的OV也可以支持CART细胞的浸润和激活。

在TME中对抗免疫抑制信号：

TME内的许多分子抑制途径都会负面调节T细胞功能，包括来自各种细胞的免疫检查点受体信号传导（例如PD-）免疫检查点抑制剂（ICIs）在使TME内的T细胞恢复活力方面具有显着的临床活性[6]，从而促进了配备免疫检查点抑制剂（ICIs）的OV的发展，目的是将ICI更选择性地递送至TME，从而避免它们的全身递送相关的毒性。许多实体肿瘤表达活化的CAR-T细胞产生的PDL和IFN-γ进一步促进PD-L表达[6,43]。携带PD-L迷你抗体（HDPDL）结合人表皮生长因子受体的溶瘤腺病毒的治疗。HER特异的CART细胞在前列腺癌模型中增强了抗肿瘤功效，并且通过OV载体递送ICI优于全身施用ICI[43]。因此，配备ICI的OV可以增强CAR-T细胞功能通过肿瘤内阻断PD-/PD-L抑制途径。

预防抗原阴性复发：

与其他抗原特异性疗法一样，CAR-T细胞治疗可促进肿瘤免疫编辑，从而导致抗原阴性肿瘤细胞的出现[3,4]。在实体瘤中，抗原逃逸是由肿瘤细胞组成的高度异质性引起的。OV直接溶解肿瘤细胞并引起促炎环境，增加了针对TAA的启动作用。但是，OVs也可以配备双特异性T细胞衔接子（BiTE）以选择性地靶向TAA，这可能会通过抗原丢失进一步减少肿瘤的免疫逃逸。BiTE由CD3scFv和靶向特定TAA的scFv组成，因此它们将T细胞瞬时定位在肿瘤细胞上并激活T细胞，导致肿瘤细胞裂解[44]。研究者证明，叶酸受体-α特异性CART细胞结合在一起带有靶向BiTE的EGFR的腺病毒用CART细胞直接杀死肿瘤细胞并通过靶向第二种抗原的BiTE募集非CART细胞来增强结肠癌异种移植模型中的肿瘤控制[44]。

与BiTEs类似，膜整合的T细胞衔接子（MiTEs）通过CD3scFv将T细胞定位于肿瘤细胞表面，从而导致肿瘤细胞裂解。但是，MiTE保留在肿瘤细胞的膜上，因此只有被MiTE武装的OV感染的肿瘤细胞才会被靶向裂解。尽管这将T细胞活化限制在OV感染的细胞上，但与BiTEs相比，这种方法可能会限制靶向作用和非肿瘤效应，因为活化取决于病毒的靶向性而不是特定表面标志物的表达[9]。

综上所述，这些研究提示配备MiTE或BiTE的OV可以通过靶向多个TAA来抵抗抗原阴性的复发。

----当前的局限性和未来方向----临床转化挑战：

尽管进行了大量的临床前研究并取得了可喜的结果，但只有一项批准的临床试验评估溶瘤病毒与CAR-T疗法联合治疗HER阳性癌症（NCT）。临床前的结果很难转换为临床试验，因为临床前的模型经常使用免疫缺陷（NSG）小鼠，并且该实验系统无法在完全有能力的免疫系统的背景下模拟OV和CART细胞之间的相互作用。

此外，OVs和CAR-T细胞的联合疗法引起了关于将两种有效的促炎性免疫疗法联合使用的安全性的问题。尽管CD9定向的CAR-T细胞已获得FDA批准，但它们仍具有威胁生命的不良事件的风险，例如细胞因子释放综合征和严重的神经毒性[]。尽管唯一获FDA批准的OV（T-VEC）耐受性相对较好，但武装OV增强T细胞功能的药物可能会增加CAR-T细胞副作用的发生率和/或严重性[3]。因此，至关重要的是建立彼此结合的这些药物的安全剂量。另一个重要的考虑因素是成本。目前产生用于治疗的CAR-T细胞的策略每单位成本较高[45]，而整个T-VEC治疗过程的成本估计约为65,美元[46]。将这些治疗药物结合使用也要结合其成本，这可能会成为广泛使用的重要障碍。

递送：

OV疗法的挑战之一是成功地将病毒传递到肿瘤部位。尽管许多临床试验正在研究肿瘤内给予OVs的方法，但全身性给药更适合于靶向转移性癌症。4然而，在血液中，OVs在血清中遇到中和因子，被隔离在肝脏和脾脏中，并损害了向肿瘤的外渗。全身性给药也可能引起细胞因子风暴反应，从而导致严重的全身性炎症甚至死亡。47尽管采用了诸如载体细胞，聚合物包被和靶向肿瘤血管内皮的策略来规避这些挑战，[4]OVs与CAR联合使用T疗法可能不需要浸润转移部位以促进其清除。正如Rosewell等人在他们的研究中发现的那样，配备PD-LICI的OV不能浸润淋巴结转移，但是接受该OV的小鼠的HER.CART细胞仍然显示出对转移的更好控制。48也许CAR的活性增强了原发性肿瘤部位的T细胞足以改善转移灶的CART细胞清除率，尽管应使用其他CAR构建体和肿瘤模型进行进一步研究。为了克服OV传递的障碍，一组使用CART细胞在肿瘤部位沉积病毒。49他们成功地在CART细胞中加载了OV，并在不损害CART功能的情况下将OV传递至肿瘤细胞，以及HER.CART之间的协同作用。细胞和溶瘤性水疱性口炎病毒（VSV）被观察到针对乳腺癌细胞系。尽管该有趣的系统在体外显示出希望，但其在体内的应用可能限于免疫学上较热的肿瘤，因为在这种情况下，如果没有细胞首先浸润肿瘤以沉积OV，OV就无法增强CART的浸润。

扩大武装OVs与CART细胞的组合：

由于CD9特异性CART细胞表现出最强的临床前和临床疗效，研究人员产生了一个带有人CD9转基因的OV，旨在迫使CD9在实体肿瘤细胞上表达，使其可被CD9特异性CAR靶向-T细胞。在B6黑色素瘤模型中，配备有鼠CD9的OV使CD9特异性CAR-T细胞减慢了肿瘤的生长。

另一小组使用类似的方法将CD9递送至MC38肿瘤[5]，他们观察到当CD9特异性CART可以提高抗肿瘤功效。将其细胞与截短的CD9武装OV组合注入[5]。即使这一概念在概念上具有吸引力，但由于不必要地消除了正常的B淋巴细胞和病毒的有限生物分布，其临床潜力仍然值得怀疑。OVs感染性的显着改善可能是该策略实现临床疗效所必需的。

还有一些转基因可以与CAR-T细胞疗法很好地协同作用，但仍未经测试。就改善向实体瘤的运输而言，CAR-细胞与靶向TME物理屏障的OV的组合尚待探索。配备有透明质酸酶[53]和基质金属蛋白酶8（MMP-8）[54]的OV在临床前模型中均表现出OV的肿瘤内扩散增加，这两者均降低了实体瘤的致密ECM特性。将该OV与CAR-T细胞组合也可以改善CAR-T细胞的浸润并因此提高其抗肿瘤活性。

靶向细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）的单克隆抗体（mAb）以及靶向PD-的单克隆抗体最近获得了FDA的批准用于黑色素瘤的治疗，这表明通过OV载体阻断CTLA-4[55]。Engeland等人描述了一种带有全长抗CTLA-4mAb的溶瘤性麻疹病毒（MV）。他们证明，与具有免疫功能的小鼠模型中的天然OV相比，该OV改善了对肿瘤的控制。然而，作者确实报告说，全身性aCTLA-4治疗与天然MV相结合比，MV-aCTLA-4具有更好的存活率[55]。但是，应探索将CART细胞与编码封闭性CTLA-4试剂的OV结合使用。

另一种潜在的方法是使用OV修饰TME的代谢，使其对CAR-T细胞更友好。近年来的研究表明了新陈代谢在T细胞生物学中的重要性。例如，CD39和CD73将细胞外ATP水解为免疫抑制腺苷，该腺苷可在TME中积累并损害T细胞功能。CD39阻断抗体可改善具有免疫功能的小鼠模型中奥西铂化疗的疗效，从而推动了一项临床试验，研究该抗体与PD-阻断抗体（NCT）的疗效[56]。用该抗体为OV武装可能代表了通过减少腺嘌呤能信号传导来改善CART细胞疗法的有前途的方法，同时通过OV内在作用刺激T细胞。

即使将CAR-T细胞与OVs结合可以克服TME的挑战，联合治疗也可能带来独特的问题。最近的工作描述了一种编码IFN-β转基因的VSV，它通过促进CART细胞的凋亡来干扰CAR-T治疗。然而，去除IFN-β转基因可降低CAR-T细胞的损耗[59]。包括IFN-α和IFN-β的I型IFN刺激免疫系统，但慢性I型IFN信号传导可导致免疫功能障碍[60]。促炎和抗炎双重性是免疫分子的共同特征，这使得设计联合疗法变得棘手，并且需要达到平衡。蛋白质组在恶性肿瘤之间的异质性，甚至可能具有相同恶性肿瘤的患者之间的异质性，可能会使联合治疗进一步复杂化。当与CAR-T细胞疗法联合使用时，应仔细考虑用于武装OV的转基因的潜在免疫抑制作用。

----结论----

实体瘤中的TME具有多种免疫抑制机制的特征，这些机制可能需要同时抑制不同的途径才能根除肿瘤。OV的大量载运量可用于表达多种转基因，包括趋化因子，细胞因子，ICI和BiTE以及其他分子，以形成TME并促进CART细胞的抗肿瘤作用[48]。此外，工程流程的高度灵活性OVs和CAR-T细胞的结合可以针对靶肿瘤和TME的特定特征定制最合适的基因组合和CAR-T细胞共刺激。尽管绝大多数OV研究均针对实体恶性肿瘤，但将武装OV与CART治疗结合使用以对抗血液恶性肿瘤可减少疾病复发。

~本文DOI:0./hum.00.78

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