最好的白癜风医院 http://pf.39.net/bdfyy/xwdt/●全文速览●病毒是对人类健康威胁最大的病原之一，由其引发的病毒性疾病对人民健康、国家安全和社会经济构成重大威胁。病毒感染机制研究对病毒性疾病的防控及治疗具有重大意义。病毒侵染宿主细胞的动态过程涉及病毒组分与多种细胞组分或细胞器间复杂的相互作用，但是传统手段无法对该动态过程进行实时跟踪研究。单病毒示踪技术作为一种可以实时原位示踪单颗病毒侵染过程的技术，在病毒感染机制研究方面起着愈来愈重要的作用。借助于该技术，能够获取病毒侵染过程中病毒入胞途径、胞内转运过程、病毒核酸释放及其与细胞间的相互作用等动态过程信息，从而对病毒的感染机制进行分子水平的深入研究。本文结合本课题十五年来的研究工作就单病毒示踪技术所涉及的测量技术、标记技术、信息获取进行阐述，总结归纳了单病毒示踪在病毒感染机制研究中的最新进展，并探讨了该技术目前存在的挑战性问题以及未来发展的方向。●背景介绍●由病毒引发的病毒性疾病对人民健康、国家安全和社会经济构成重大威胁，全面深入解析病毒的感染过程，对理解其致病机制、建立诊疗方法、制定防控措施至关重要。病毒依赖宿主细胞完成增殖，其感染过程是在时空动态变化过程中依次发生的大量瞬时分子事件的集成，包括受体识别、内吞、胞内转运、核酸释放、复制、包装、子代病毒释放等一系列步骤，每个步骤又涉及多样的途径和复杂机制。病毒的多样性及复杂多变的感染过程使得病毒致病机制的研究一直以来都是生物医学研究中亟待解决且尚未很好解决的关键科学问题。传统的静态检测技术（如生化实验、透射电镜成像等）可以获取病毒结构，从而解析病毒在某个特定时间、空间、平均化的感染信息。然而，病毒感染过程是时间、空间、结构、活性不断变化的生物事件，仅仅依赖静态技术，难以获得病毒侵染动态过程真实详细的信息，则更难以揭示其感染机制。单病毒示踪技术不仅可以对多个病毒侵染过程进行群体化示踪，也可以对单个病毒在细胞内的侵染行为进行个性化分析，已成为研究病毒感染机制的热门技术。借助该技术，研究者能够获取病毒侵染过程中病毒入胞途径、胞内转运过程、病毒核酸释放及其与细胞间的相互作用等动态信息，弥补了静态研究手段的不足，从而获得更精细复杂的信息并真实诠释病毒侵染的时空动态过程，这对全面解析病毒的感染机制，设计新的抗病毒药物等具有重大意义。●图文要点解析●1单病毒示踪方法的建立单病毒示踪方法需利用实时、原位、动态测量技术对荧光标记的病毒颗粒进行示踪，获取信息并通过进一步的处理分析以解析病毒感染细胞的过程，进而对其感染机制进行诠释。该方法的建立主要涉及测量技术、标记技术和信息获取三个方面。要点：
（1）测量技术：单病毒示踪技术对成像装置和标记技术要求比较高，检测的单病毒荧光信号需要足够强，以满足单病毒动态行为精细分析的需求。同时，在进行单病毒示踪时，样品往往需要被多次激发以实时获取足够的数据，以便对病毒动态行为进行统计分析，所以对病毒或宿主细胞的光损伤也是选择仪器的一个限定因素，成像时也需尽量减少曝光时间及激发光强度。当示踪活细胞内的病毒颗粒时，细胞的自发荧光往往会严重干扰荧光信号比较弱的目标物，所以为了确保获得较高信噪比的图像，应尽量减小激发体积以减少背景吸收而降低背景荧光。因此，一般用于单病毒示踪的成像系统要具备检测器灵敏度高、成像速度快、激发体积小等特点。
（2）标记技术：实施单病毒示踪的前提是在尽可能不影响病毒功能的条件下对病毒颗粒的多种特定组分进行荧光标记。由于病毒颗粒小且结构复杂，因此，温和高效的标记往往是实现单病毒示踪的关键。标记策略对标记技术影响也很大，如何建立温和、高效、特异、定点、定量的原位标记方法，并尽可能减少对病毒活性的影响，从而获取真实可靠的测量信号是目前单病毒示踪领域需要解决的关键问题之一。（3）信息获取：通过显微成像装置获取荧光标记的病毒运动的序列图像之后，需要对图像中所包含的病毒颗粒运动的信息进行提取，以获得和病毒侵染过程相关的速度、运动轨迹、相互作用等信息（图1）。相关信息获取主要包括病毒颗粒定位、轨迹重建、轨迹分析及病毒或病毒组分与宿主细胞组分相互作用分析等过程。图1单病毒示踪的成像过程
2单病毒示踪在病毒研究领域已取得的进展
病毒感染宿主细胞的过程大致如下：病毒进入细胞、转运至细胞特定位置、释放基因组、复制子代病毒组分、组装并释放子代病毒。子代病毒可继续感染新的宿主细胞，进入下一轮复制周期。对大多数病毒来说，完成一轮感染只需4-16h。在如此短暂的时间里，发生着一系列病毒与宿主细胞不同结构的精细、复杂的相互作用，单病毒示踪技术正是研究这些相互作用的。2.1病毒入胞
为感染宿主细胞，病毒需先跨过细胞质膜屏障，进入细胞内部。根据质膜参与形式的不同，病毒进胞的方式一般可分为两种：与质膜融合和被细胞内吞。除HIV、伪狂犬病毒等主要通过与质膜融合进入细胞外，大部分病毒通过胞吞作用进入细胞，如登革热病毒、乙型肝炎病毒、牛痘病毒等。
图2甲型流感病毒通过依赖网格蛋白和不依赖网格蛋白内吞途径进胞要点：（1）以甲型流感病毒（influenzaAvirus，IAV）为例，IAV结合到细胞上以后，极少数会利用质膜上现成的网格蛋白包被小窝进胞，绝大部分的病毒会在其结合的位置募集网格蛋白形成新的包被小窝，从而进入细胞。（2）年，本课题组研究表明IAV与质膜结合后先募集网格蛋白，待募集量达到平台后立即募集能使质膜分裂的发动蛋白，发动蛋白一旦募集完成就立即从包裹病毒的囊泡上解离下来，网格蛋白紧随其后进行解离，几秒钟后包裹在囊泡内的病毒迅速向细胞内部转运。（3）并不是所有募集了网格蛋白和发动蛋白的病毒都能进入细胞。粗略估计，只有10%左右的IAV病毒能结合到宿主细胞表面，而结合到细胞上的病毒中也只有不到20%能启动募集网格蛋白，这其中又只有30%左右的病毒能募集到足够的相关蛋白进入细胞。此外，病毒进胞是不同步的，同时结合到细胞膜上的病毒，有的一两分钟内就可进入细胞，有的则需要半个小时甚至更长时间才能进胞。
2.2病毒在细胞内转运
通过胞吞作用进入细胞的病毒被包裹在胞吞泡中沿细胞骨架向细胞核或核附近转运。几乎所有通过胞吞作用进胞的病毒都依赖Rab5调控的内体进行转运，需要更低pH释放基因组的病毒还依赖Rab7调控的内体进一步转运。另外，病毒的转运过程主要是沿微丝和微管骨架定向地进行的。
图3甲型流感病毒利用“驱动转换”机制在细胞内转运
图4单病毒示踪研究甲型流感病毒不依赖于Rab5蛋白的细胞自噬转运过程要点：（1）以IAV为例，本课题研究发现进入细胞的病毒大部分被包裹在含Rab5的早期内体中，在肌球蛋白VI驱动下沿微丝进行短距离转运，而后在动力蛋白驱动下沿微管向细胞核转运，到达细胞核附近后，在微管支撑下，含Rab5的内体募集Rab7或与含Rab7的内体融合，使病毒被包裹在同时含Rab5和Rab7的过渡内体中，过渡内体进一步成熟为只含Rab7且pH更低的晚期内体，为IAV提供释放基因组的酸性条件。（2）IAV还会利用细胞的自噬过程进行转运，进入细胞的病毒中约有20%会被包裹在不含Rab5的自噬体中沿微管向细胞核定向转运。（3）与超低的进胞效率不同，病毒在胞内的转运效率极其高，几乎所有进入细胞的病毒最终都能转运到细胞核附近。2.3病毒释放基因组及组装和出胞病毒到达细胞内部区域后，要将基因组从致密的包裹中释放到细胞质或细胞核中，才能进行后续复制过程。内吞进胞的病毒大多通过包膜与内体膜在低pH下融合释放基因组。病毒将基因组从内部释放出去后，还需复制子代核酸、合成子代蛋白并将关键组分组装成子代病毒粒子、释放到细胞外。图5单病毒示踪研究甲型流感病毒的基因组释放过程
图6子代伪狂犬病毒核衣壳在细胞核内组装过程要点：（1）单病毒示踪研究病毒核酸释放的方法主要有两类：监测病毒包膜与内体膜融合和监测病毒核酸与包膜分离。（2）年，Cui等人用三种颜色的量子点分别标记IAV的核酸和包膜，通过观察不同颜色量子点在细胞核附近的分离情况，发现进入细胞的病毒中约有30%在细胞核附近释放了基因组。（3）不同的子代病毒的组装与释放存在很大的差异。单病毒示踪在子代病毒关键组分转运和组装动力学以及作用机制的研究中具有很大的优势并取得了一些重要进展。3.目前存在问题和对策虽然单病毒示踪技术在病毒研究中已取得了很大进展，但作为一种发展中的新兴技术仍存在一些问题需要克服。如标记技术中，在标记物的选择和标记策略的设计方面，迫切需要发展针对病毒不同结构和组分的温和、特异、高效的原位标记方法，并实现对特定组分的定点定量标记，确保其天然感染能力。可能的对策是活细胞合成与原位标记一体化融合、无机-生物体系融合、细胞内生化反应途径与基因操纵策略相融合。此外，在测量技术上，如何提取并精准转换病毒在复杂宿主细胞中感染的瞬时、动态、小概率事件信息，发展微弱信号原位转换与放大、动态多元信号整合等新策略，并通过大量信息的处理与统计分析以正确认识和诠释病毒感染机制仍面临一些瓶颈，亟待系统性地突破。●总结与展望●病毒感染过程非常复杂，随着时间和空间的变化，病毒的结构和生物活性以及病毒或病毒组分与宿主细胞组分的相互作用等也都在不断变化。虽然目前的单病毒示踪方法已经取得了可喜的研究进展，并且也在病毒学研究中得到了一些应用，甚至有一些新的发现，但是，方法本身还需进一步完善，特别是亟待发展温和高效的动态标记技术和海量数据的快速获取与分析技术。作为一种强有力的工具，单病毒示踪应该尽可能应用于研究和诠释诸如流感病毒、艾滋病毒、新冠病毒等重要病毒的感染机理、细胞与细胞之间的传播机理、活体感染及致病机理等，为建立诊疗方案、药物研发以及制订防控措施等奠定必需的基础。选择频发感染的病毒如流感病毒为对象，详细地研究和记录其感染的动态全过程，作为病毒学入门的实况教材，便于更直观和牢固地掌握病毒学基本知识，也具有更普适性的意义。活体水平病毒感染过程的示踪测量可为认识病毒的感染和致病机理提供最真实可靠的信息，但由于情况更复杂、难度更大，目前还没有能满足病毒活体三维长时间动态示踪要求的方法。关键是，首先需要发展适用于病毒活体示踪的标记物，近红外II区量子点可能是目前最值得考虑的一类。当然，同时还需要建立合适的标记策略。有了理想的标记物和相应的标记策略后，还需发展相适应的测量技术。活体内高时空分辨三维单病毒示踪新技术新方法已开始引起研究者的重视。总之，随着荧光性能优异的量子点等新型标记材料的出现和高时空分辨测量技术的发展而不断完善的单病毒示踪方法，将会在病毒学研究甚至重大病毒性传染病的防控中发挥越来越重要的作用。通讯作者简介
庞代文，年武大物理化学（电化学）学士，年电化学博士。年武大病毒学系博士后（生物电化学）出站评为副教授并入职化学系任教。年破格晋升教授，年任分析化学博导。年至年任武大化学与分子科学学院院长。年调南开大学化学学院任杰出教授。现任（曾任）国家纳米科学技术指导协调委员会专家组成员（-）、全国纳标委纳米光电显示技术标准化工作组组长（-）、“纳米研究”国家重大科学研究计划专家组成员（-）、“纳米科技”国家重点研发计划实施方案（）和指南（-）编制专家组成员、美国化学会Anal.Chem.顾问编委（-）、英国皇家化学会NewJ.Chem.副主编（-）、J.Electroanal.Chem.编委（-）等，年12月当选美国医学与生物工程院（AIMBE）Fellow。
主要从事动态生物成像（量子点单病毒示踪）和量子点背光显示技术研究。曾主持杰青项目（），两次担任国家重大科学研究计划（）项目首席科学家（-；-）、国家基金委创新群体（-）学术带头人和国家传染病重大专项（-）课题负责人等。发表SCI论文多篇，SCI他引1.8万多次；授权发明专利35件；国内外邀请报告余次；参与两项（；）量子点国家标准制订；量子点标记试剂获第七届中国国际高交会“优秀产品奖”（）（用户达1千多家）。活细胞合成量子点成果入选《“十一五”国家重大科技成就展（）》，“荧光纳晶活细胞合成及其生物标记性能的调控”获湖北省自然科学一等奖（），“DNA表面化学及基于DNA的生物传感”获教育部自然科学一等奖（）。所研发的高质量量子点已突破高温加工难题，用于背光显示，竞争力强劲。其它更多具体详细的信息请参考该课题组网站：
